草胡椒属动物抗肿瘤感化及其感化机理钻研

  天然产品是抗肿瘤药物研发的主要源泉,.

  天然产品是抗肿瘤药物研发的主要源泉,目前40%以上的临床用药来历于天然产品及其衍生物,此中包罗紫杉醇、碱、鬼臼毒素和喜树碱等。草胡椒属动物正在云南、贵州等地平易近间被用做保守抗肿瘤药物,但对其抗肿瘤的相关机制引见并不多见。本论文以三种草胡椒属动物为研究对象进行抗肿瘤活性的初步阐发,并匹敌肿瘤活性较强的豆瓣绿进行了机制研究,初步阐了然豆瓣绿及其化学成分肿瘤细胞增殖和细胞凋亡的机制。同时对豆瓣绿乙醇提取物的分歧萃取部位及单体化合物进行了抗肿瘤活性筛选确定。(1)使用MTT法评价了石蝉草、豆瓣绿、草胡椒的乙醇提取物对人单核细胞白血病U937细胞增殖的影响。成果表白这三种动物均能够显著U937细胞增殖,且豆瓣绿细胞增殖的活性最强。然后我们调查了豆瓣绿乙醇提取物、乙酸乙酯萃取部位和萃余水层U937细胞增殖的活性,成果发觉其乙酸乙酯萃取部位具有最强的活性,猜测其可能是豆瓣绿抗肿瘤的无效部位。(2)切磋了豆瓣绿提取物对人单核细胞白血病U937细胞凋亡的机制。采用Hoechst 33342荧光染色察看发觉豆瓣绿乙醇提取物和乙酸乙酯萃取部位均可U937细胞凋亡。采用Annexin V-FITC和PI染色,发觉其乙酸乙酯萃取部位呈量效和时效关系细胞凋亡。通过PI染色,发觉豆瓣绿的乙醇提取物和乙酸乙酯萃取部位还可使U937细胞细胞周期发生阻畅,表示为G2/M期细胞比例较着削减、S期增加、G1期削减。采用Westren Blot手艺,发觉豆瓣绿乙酸乙酯萃取部位惹起U937细胞细胞周期相关卵白:细胞周期卵白D1(CCND1)、细胞周期卵白B1(CCNB1)和周期卵白依赖性卵白激酶1(CDK1)表达显著削减。进一步的研究表白,豆瓣绿的乙酸乙酯萃取部位可激活半胱天冬氨酸卵白酶-8(Caspase-8),促凋亡卵白Bid裂解,下逛的效应Caspase半胱天冬氨酸卵白酶-3(Caspase-3)被激活;另一方面,乙酸乙酯萃取部位还可惹起活性氧(ROS)升高,线粒体膜电位(MMP)下降,Bax表达升高,半胱天冬氨酸卵白酶-9(Caspase-9)活化和Caspase-3激活。由此得出豆瓣绿乙酸乙酯萃取部位可通过Caspase依赖的外源路子和线粒体调理的内源路子细胞凋亡。(3)筛选了豆瓣绿乙酸乙酯部位抗肿瘤的活性成分。为探究豆瓣绿乙醇提取物U937细胞增殖的次要活性部位,对豆瓣绿乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等无机溶剂萃取部位和萃余水层的抗肿瘤活性进行了检测。成果表白,豆瓣绿的石油醚部位和乙酸乙酯部位具有较强的U937细胞增殖的活性。选用豆瓣绿乙酸乙酯部位,通过硅胶柱色谱法,用氯仿和甲醇进行梯度洗脱,获得7个分歧组分1-7。检测各组分细胞毒活性发觉:组分1、2和7均具有U937细胞增殖的活性,且组分1的活性最强。我们从豆瓣绿乙酸乙酯部位平分离纯化获得3个单体化合物。随后我们调查了三个化合物对人单核细胞白血病细胞U937,黑色素瘤细胞A375,人皮肤鳞状表皮癌细胞A431和膀胱癌细胞T24细胞增殖的影响。成果表白:化合物1(Peperobtusin A)的细胞毒活性最好,对多种肿瘤细胞均具有显著增殖的活性。化合物2和3对几种肿瘤细胞性较差。以上成果申明组分1是豆瓣绿乙酸乙酯部位抗U937细胞增殖的次要活性成分,而Peperobtusin A可能是其阐扬细胞毒感化的次要活性成分之一。(4)研究了Peperobtusin A对人单核细胞白血病U937细胞凋亡的机制。使用Annexin V-FITC染色,对Peperobtusin A惹起A431和U937细胞凋亡进行检测,发觉不异感化浓度下Peperobtusin A惹起U937细胞凋亡更较着。研究还发觉Peperobtusin A使U937细胞细胞周期发生S期阻畅。进一步研究表白,Peperobtusin A可以或许惹起U937细胞活性氧升高,线粒体膜电位降低,Caspase-8、Bid、Caspase-9和Caspase-3卵白裂解添加,Bax表达升高。同时,发觉用Caspase剂Z-VAD-FMK预处置后可显著降低Peperobtusin A惹起的U937细胞凋亡率,连系剂处置后Western Blot成果,揣度Peperobtusin A通过Caspase依赖性凋亡路子细胞凋亡。有研究表白有丝原活化卵白激酶(MAPK)信号通取细胞凋亡亲近相关。对P38MAPK信号路子中的P38和P-P38进行研究,阐发药物零丁处置和Z-VAD-FMK、B203580别离预处置后成果,表白P38MAPK-Caspase-9参取Peperobtusin A的细胞凋亡。

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